Protocolo: PCR

"Reacção em cadeia da polimerase (em inglês Polymerase Chain Reaction - PCR) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo, por exemplo, Escherichia coli (bactéria) ou leveduras."

O processo consiste basicamente em abrir a fita de DNA, adicionar bases para formar uma fita complementar a cada um dos lados da fita aberta, formando 2 fitas a cada ciclo. Esse processo é repetido quantas vezes necessário, tendo a cada ciclo duas vezes mais fitas que o anterior.


PROTOCOLO BASICO:

                          Volume(µL)
H2O:                11,75
Tampão:             2
MgCl2:              1,8
dNTP:               0,2
Primer F:           0,5
Primer R:           0,5
Taq:                  0,25
DNA:               3

Obs: Ordem de menor preço para maior preço

Resumo: Aconselhamento Genético e Diagnóstico Pré-natal

Aconselhamento genético:

Conjuntos procedimentos → informar e orientar indivíduos em relação → ocorrência ou risco → doença genética.

Objetivos:

1. Fornecer diagnóstico médico e implicações → tratamento (se possível);

2. Risco de recorrência → descendentes e outros parentes;

Diminuir angustia e sofrimento → causados por doença genética → ajuda tomar decisões racionais;

Reduzir ansiedade sentimento de culpa dos pais.

Aconselhamento pode ser: prospectivo e retrospectivo.

Prospectivo: previne → doença genética na família → fornecimento risco teórico.

Exemplos:

1. Casais risco → prole afetada → idade avançada,

2. Mães expostas agentes teratogênicos,

3. Identificação → heterozigotos,

4.Casamentos consanguineos.

Aconselhamento retrospectivo → existe afetados na família.

Exemplos → Mulher filha de hemofílico → chance filho ser hemofílico;

Casal primogênito → anencefalia →

chance outro filho afetado.

Etiologia e investigação das doenças genéticas:

Suspeita-se alterações cromossômicas → malformações congênitas múltiplas, deficiência mental, amenorréia primária, abortos múltiplos e esterilidade.

Averiguação doenças cromossômicas → inicialmente → cromatina sexual, triagem possíveis alterações cromossomos sexuais.

Casos genitália ambigua → sexo cromossômico.

Investigação doenças monogênicas e multifatoriais:

Análise do heredograma da família,

Consulta bibliografia

Triagem doenças genéticas:

1. Detecção precoce indivíduos afetados → teste do pezinho → fenilcetúria, galactosemia e outros erros metabólicos → tratados com dieta alimentar restritiva ou substitutiva;

2. Identificação indivíduos → risco transmitir doenças genéticas → triagem heterozigotos

Diagnóstico Pré-natal:

Objetivo → obter informações → sobre feto → caso de risco → nascer criança anormal.

Principais métodos diagnóstico pré-natal → doenças genéticas e defeitos congênitos:

1. Alfa-fetoproteína → alfa-1-globulina → saco vitelino e fígado fetal → níveis alterados líquido amniótico e soro materno → defeito tubo neural e outras anomalias;

2. Teste triplo ou triplo marcador → três marcadores bioquímicos → soro materno → alfa-feto-proteína, estriol-não conjugante e gonadotrofina coriônica humana → risco aproximado de alterações cromossômicas → dois primeiros marcadores níveis reduzidos e último elevado;

3. Ultra-sonografia → orientar coleta de material e detecção anomalias anatômicas

4. Amniocentese → 16^a semana → utiliza líquido amniótico → células presentes → cultura → análise citogenética e testes bioquímicos específicos;

5. Análise DNA diagnóstico pré-natal

Resumo: Imunogenética

Genes de anticorpos compostos de segmentos.

Cada segmento tem várias cópias → uma difere pouco da outra.

Maturação do linfócito → segmentos unidos → criar gene da imunoglobulina.

Cópia cada segmento usado → aleatória → com várias cópias de cada segmento → várias combinações possíveis.

\

Consideremos montagem dos anticorpos → cadeias leves de imunoglobulinas.

Cadeias kappa e lambda → codificadas genes em diferentes cromossomos.

Cada gene → três segmentos 1. V → variávies

2. J → junção

3. C→ constante

Segmentos V → codificam maior parte região variável das cadeias leves

Segmentos C → região constante da cadeia.

Segmento J → codificam trecho curto de nucleotídeos → unem segmentos V e C.

Gene humano → kappa na linhagem germinativa:

30 a 35 diferentes genes segmentos V,

B. 5 genes diferentes J,

100. Único gene segmento C.

Após ter ocorrido recombinação somática → gene recombinado V-J-C é transcrito e processado.

mRNA traduzido em cadeia leve funcional.

Assim célula humana B produz único tipo de cadeia kappa leve.

Gene que codifica cadeia lambda leve → organizado de maneira semelhante:

29 a 33 segmento gene V,

B. 4 ou 5 genes V e C.

Recombinação somática ocorre entre os segmentos de modo igual que nos segmento kappa.

Gene codifica cadeia pesada imunoglobulina → segmentos V, J e C, mas também segmentos D → para diversidade.

Recombinação somática → maturação do linfócito → une segmento gênico D ao segmento J e um segmento V é unido ao segmento combinado D-J.

A recombinação somática → proteínas RAG1 e RAG2→ geram quebras bifilamentares em sequências específicas de nucleotídeos → sequências de sinal de recombinação flanqueadoras dos segmentos gênicos V, D, J e C.

Proteínas de reparo do DNA → processam e unem as pontas de determinados segmentos.

outros mecanismos aumentam a diversidade dos anticorpos:

1^o Cada tipo de cadeia leve combina-se com cada tipo de cadeia pesada,

2^o Processo de recombinação que une segmentos V, J, D e C na célula B é impreciso → alguns nucleotídeos aleatórios são perdidos ou ganhos nas junções.

Esta diversidade juncional → acentua variação entre anticorpos.

3^o alta taxa de mutação → hipermutação somática → característica dos genes de imunoglobulina.

Diversidade dos receptores de células T.

Cada célula especificidade genética para tipo de antígeno mediada pelos receptores da célula.

Receptores de célula T → estruturalmente semelhantes a imunoglobulinas → cadeia polipeptídica alfa e beta unidas por ponte dissulfeto

Cada cadeia do receptor de célula possui região constante e região variável.

Regiões variáveis das duas cadeias dão o sítio de ligação com o antígeno.

Genes cadeias alfa e beta → feito de segmentos que sofrem recombinação somática antes do gene ser transcrito.

Cadeia beta → é igual cadeia alfa mas contém segmento D

Ocorrem combinações aleatórias de cadeias alfa e beta e diversidade juncional.

Genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade.

Tecidos enxertados são detectados e atacados pelas células T.

Antígenos que provocam rejeição do enxerto → antígenos de histocompatibilidade → grupo de genes → Complexo Principal de Histocompatibilidade

Tecidos enxertados são detectados e atacados pelas células T.

Antígenos que provocam rejeição do enxerto → antígenos de histocompatibilidade → grupo de genes → Complexo Principal de Histocompatibilidade

\Genes MHC → mais variáveis conhecidos → mais de 100 alelos para alguns loci de MHC.

Cada pessoa possui cinco ou mais loci de MHC → não existe duas pessoas com o mesmo conjunto de antígeno de histocompatibilidade.

Variação nos antígenos de histocompatibilidade → identidade única para nossas células → sistema imune distingue o próprio do não próprio

Genes e Transplantes de Orgãos

Rejeição ao tecido transplantado pode ser parcialmente inibida → drogas → interferem na imunidade celular.

Porém este tratamento → inibe combate a patógenos comuns → transplantado morre de infecção.

Outra opção controlar a reação imune → ajuste entre o doador e receptor → maximizando as semelhança genéticas.

Gravidade rejeição imune → depende do número de antígenos de MHC não- correspondentes nas células do tecido transplantado.

Antígenos do grupo sanguíneo ABO → provocam forte reação imune.

Doador ideal → gêmeo idêntico.

Próximo melhor doador → irmão com o mesmo antígeno de MHC e ABO.

Doador da população → feita tentativa de compatibilidade de tantos antígenos possíveis de MHC entre doador e receptor

O sucesso a longo prazo do transplante → depende da proximidade da compatibilidade.

Resumo: Genética do cancer

Doenças genéticas de células somáticas → mutações genes → alteração multiplicação celular.

Todo cancer → mutações DNA

Células normais → regulação precisa crescimento.

Células podem escapar → mecanismo controle do crescimento → dividem-se descontroladamente.

Tumor pode ser → benigmo ou maligno.

Benigmo → autolimitante → não disseminam tecidos adjacente, não formam metástase.

Maligno → crescimento ilimitado → dissiminam-se tecidos vizinhos por metástase.

Características das células cancerosas:

A. Multiplicação descontrolada;

B. Alterações morfológicas → mais arrendodadas → possivelmente por → menos adesivas células normais circundantes e → membrama celular mais fluida → fluxo diferentes substâncias;

C. Perda inibição por contato;

D. Perda da afinidade celular específica → adesão

preferencial células com características

semelhantes;

E. Propriedade imunológicas diferentes → presença

antígeno tumorais na membrana celular;

F. Desdiferenciação → menos especializadas

G. Invasibilidade → estruturas capacitam invadir

espaço disponível;

H. Maior e rápida capacidade captar glicose que

células normais;

I.Utilização metabolismo anaeróbico → grande quantidade ácido lático;

J. Citoplasma indiferenciado → organelas maldesenvolvidas, mudanças degenerativas frequentes

Origem

monoclonal.

Aspectos genéticos:

A. Alguns tipos (raros)

B. Predisposição familiar ao câncer

C. Associação vários tipos de câncer e aberrações cromossômicas;

E. Fatores genéticos → maior importância → câncer precoce e doença bilateral que → pacientes câncer unilateral e surgimento tardio;

F. Vários fatores ambientais predispõe ao câncer → radiações, vírus, substâncias químicas

Desenvolvimento do Câncer:

Duas classes de genes → proto-oncogenes e genes supressores de tumor.

Proto-oncogenes regulam→ crescimento celular e diferenciação normal.

Supressores de tumor → regulam crescimento anormal inibindo-o.

Oncogenes:

Proto-oncogenes ativados

Mecanismos de Ativação dos proto-oncogenes:

1.Mutação pontual:

Proto-oncogene ras → única mutação GGC → GTC

Mutações proto-oncogenes → induzidas agentes carcinogênicos físicos ou químicos;

2. Amplificação gênica:

Aumento cópia proto-oncogenes → 50-100 vezes → superexpressão produtos.

3. Translocação cromossômica :

Superexpressão proto-oncogene ou formação gene quimérico → oncogene myc

Cromossomo Philadelfia → translocação com fusão do proto-oncogene abl localizado cromossomo 9q34 com gene bcr localizado cromossomo 22q11.

4. ^{Ativação retroviral :}

^{Transcriptase reversa RNA → DNA → célula hospedeira}

Retrovirus adquirem oncogene célula hospedeira → transfere novo hospedeiro

Ex. Oncogene sis

Genes supressores de tumor :

Reprimir divisão celular → controle da mesma.

Função perdida ou alterada → deleção ou mutação de ponto.

Perda proteínas supressoras → desregula crescimento celular → formação tumores.

Sistema de defesa do organismo humano:

1. Sistema íntegro de reparo do DNA: genes controlam replicação do DNA → reparo deficiente DNA → instabilidade genômica → mutações, quebras cromossômicas e aneuploidias → compromete ciclo celular → formação tumores.

2. Sistema imunológico íntegro:

Célula T auxiliares →atacam células cancerosas.

Célula T citotóxica → perforina → perfura membrana célula cancerosa.

3. Ausência de telomerase e encurtamento telômeros divisão celular;

Número de divisão limitado tamanho telomero → encurta cada divisão.

Células somáticas normais → ausência telomerase.

Células cancerosas → telomerase substitue o telomero em cada divisão.

4. Apoptose: tumores → surge célula anormal que escapa do programa de apoptose.
   
   
   
   
   
   
   
   

Resumo: Erros Inatos do Metabolismo e Farmacogenética

Erros Metabólicos Hereditários → distúrbios bioquímicos determinados geneticamente → defeito enzima → bloqueio metabólico → doença

Distúrbios metabólicos são:

1. doenças metabólicas são congênitas ou surgem cedo na vida,

2. Tendem aparecer nos irmãos mas não nos genitores,

3. Ocorre em famílias com consaguinidade,

4. Não estão sujeitos a grandes flutuações quanto à sua gravidade,

5. Decorrentes de alterações enzimáticas.

maioria herança autossômica recessiva, alguns são recessivos ligados ao cromossomo X e raros autossômicos dominantes.

Quando proteína não é enzima → receptores ou

proteínas estruturais → padrão herança

dominante

\Ausência do produto Final:

Acarreta:

A. Produto final pode ser substrato → reação

subsequente → não se realiza,

B. Mecanismo controle tipo inibição retroativa →

prejudicado.

Substrato acumulado → prejudicial.

Galactosemia → Autossômica recessiva → deficiência enzima galactose-1-fosfato uridiltransferase → converte galactose-1-fosfato em glicose-1-fosfato.

Galactose acumula → fígado, cerebro e rins

2ª semana de vida → vômitos, diarréias, desidratação, icterícia, desnutrição e retardo desenvolvimento

Fenilcetúria → enzima deficiênte hidroxilase da fenilalanina → fígado → fenilalanina em tirosina.

Fenilalanina → sangue degradada via secundária → ácidos fenilpirúvico, fenilático e fenilacético → podem ser tóxicos

Bloqueio enzimático → deficiência tirosina e redução formação melanina.

Crianças normais ao nascerem → progressivamente deficientes (QI ≤20), hiperativas, irritáveis, podendo ser convulsivas.

Diagnóstico → teste do pezinho

Hipercolesterolemia hereditária

Níves elevados de colesterol → níveis elevados de LDL (lipoproteína de baixa densidade) → deficiência receptores para LDL no fígado

Gene receptores para LDL → 18 éxons → 150 mutações

Heterozigotos → riscos aumentado de cardiopatias isquêmicas precoce → colesterol forma placas paredes internas das artérias.

50% homens heterozigotos → ataque coronário em homens em torno 55 anos de idade

Mulheres → manifestações clínicas 10 a 15 anos mais tarde.

Homozigotos raros → níveis sanguineos 600-1200mg/dL de colesterol → infarto na infância → falecem na segunda ou terceira década → doença arterial coronária aterosclerótica.

Heterozigotos → 1 a 500 indivíduos caucasóides

Fibrose Cística

Distúrbio autossômico recessivo mais comum crianças caucasianas.

Pacientes tem aumento concentrações de Na⁺ e Cl^- no suor.

Doença pulmonar obstrutiva crônica → secreções espessas e infecções recorrentes.

Deficiência de enzimas pancreáticas → lipase, tripsina, quimotripsina.

Morte resulta insuficiência pulmonar e infecções → metade dos pacientes sobrevive até os 26 anos

Farmacogenética: cerca 50% sistemas enzimáticos → polimórficos → diversidade fenotípica → reações farmacológicas.

Variantes enzimáticas → diferem entre populações

Farmacogenômica: Estudo → funções e interações → genes determinam respostas → drogas.

Envolve desenvolvimento → novas drogas → com mínimo efeitos adversos.

Estudo diferenças hereditárias → suscetibilidade → ação agentes físicos, químicos e infecciosos → ecogenética.

Identificação pessoas → suscetíveis mutagênicos e/ou carcinogênicos ambientais → expostas por profissão ou acidente.

Atualmente → estudo suscetibilidade contaminantes ou poluentes ambientais → toxicogenômica.

Exemplos de distúrbios farmacogenéticos:

1. N-acetiltransferase e inativação lenta isoniazida:

Várias drogas acetiladas no fígado

Concentração isoniazida → plasma seis horas após administração → distribuição bimodal → dois grupos → inativadores rápidos e lentos

Inativadores lentos → droga acumula-se sangue → polineurite → inflamação nervosa causa fraqueza e dores musculares nos membros, pertubações sensoriais.

Risco cancer bexiga → inativadores lentos → 30%.

Deficiência de α₁-antitripsina:

α₁-antitripsina normal → Mecanismo de defesa proteases → degradam proteinas que devem ser eliminadas.

Inibidores das proteases → impede de atacar células normais.

Elastase leucocitária → não-inibida → destrói proteínas do tecido conjuntivo pulmonar → lesão alvéolos pulmonar e enfisema.

Lócus α₁-antitripsina → braço longo cromossomo 14 → Pi (inibidor de protease) → série alelos co-dominantes → dezenas variantes enzimáticas.

Deficiência Glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD):

Gene recessivo ligado ao cromossomo X → deficiência G6PD na hemácea → sensível certas drogas e alimentos → provoca crises hemolíticas, icterícea, dores lombares e abdominais, fraqueza, urina escura, diminuição número hemáceas, aumento reticulócitos .

Várias drogas como ácido ascórbico, naftalina, primaquina, vitamina K¹ e outras, provocam crise hemolíticas.

Deficiência de butirilcolinesterase e sensibilidade à succinilcolina:

Butirilcolinesterase → degrada succinilcolina ou suxametônio → relaxante muscular → período pré-operatório → causa paralisia músculos estriados → um a dois minutos.

Enzima não tem atividade normal → paralisia prolongada com apnéia por meia hora ou mais.

Causa → sistema de alelos múltiplos co-dominantes → lócus BCHE → braço longo cromossomo 3.

Baixo nível de butirilcolinesterase → compatível desenvolvimento normal → problemas → administração succinilcolina ou drogas afins.